کاربرد فیلتراسیون در آماده سازی نمونه ها در کروماتوگرافی- بخش 1

چکیده

آماده‌سازی نمونه‌ها برای کروماتوگرافی یک فرآیند چند مرحله‌ای است که نیازمند دقت و استفاده از تجهیزات مناسب می ‌باشد. استفاده از فیلترهای با کیفیت و مناسب برای هر نمونه و ستون و تنظیم دقیق مراحل آماده‌سازی می ‌تواند تاثیر قابل توجهی بر دقت و صحت نتایج داشته باشد. آماده‌سازی نمونه‌ها برای دستگاه های کروماتوگرافی یک فرآیند پیچیده و دقیق است که شامل مراحل مختلفی از استخراج نمونه تا تزریق نمونه به دستگاه می‌باشد. در این مقاله، به اهمیت استفاده از فیلتر قبل از تزریق نمونه به دستگاه و قبل از عبور حلال به عنوان فازمتحرک و انواع مختلف آنها و کاربرد هر یک به تفکیک می پردازیم.

فیلتراسیون غشایی یا ممبران فیلتر چیست؟

غشاء لایه نازکی از مواد نیمه تراوا است که وقتی نیروی محرکه روی غشا اعمال می شود، مواد را جدا می کند. فرآیندهای غشایی به طور فزاینده‌ای برای حذف باکتری‌ها، میکروارگانیسم‌ها، ذرات و مواد آلی طبیعی استفاده می‌شوند. فیلتر غشایی یا فیلتر ممبران نوعی فیلتر ساخته شده از مواد مصنوعی مانند استات سلولز، نایلون یا تفلون است که با کانال‌های به هم پیوسته ظریف یا منافذ استوانه‌ای یکنواخت برای بهبود نرخ جریان برای فرآیندهای فیلتراسیون در شیمی طراحی شده است. در واقع فیلتراسیون غشایی فرآیندی است که از یک مانع انتخابی به نام غشاء استفاده می‌کند تا بیومولکول‌ها و ذرات را بر اساس اندازه آنها جدا کند و به مولکول‌های کوچک‌تر اجازه عبور دهد و در عین حال مولکول‌های بزرگ‌تر را حفظ کند.

کاربرد فیلتر غشایی یا ممبران فیلتر در کروماتوگرافی چیست؟

غشاها با فشار به عنوان فرآیندهای محرک در فیلتراسیون غشایی املاح و در اسمز معکوس استفاده می شوند. فیلتر غشایی در کروماتوگرافی به عنوان ابزاری برای جداسازی و خالص‌سازی نمونه‌ها استفاده می‌شود. این فیلترها معمولاً برای حذف ذرات معلق، باکتری‌ها و ناخالصی‌های موجود در مایعات قبل از ورود به سیستم کروماتوگرافی به کار می‌روند. استفاده از فیلتر غشایی به بهبود دقت و صحت نتایج آزمایش کمک می‌کند.

عملکرد فیلترهای غشایی در سیستم کروماتوگرافی چگونه است؟

فیلتر غشایی که به عنوان فیلتر میکرو متخلخل یا microporous filter یا فیلتر غربالی که sieve filter نیز شناخته می شود، نوعی فیلتر است که در کاربردهای مختلف علمی، صنعتی و زیست محیطی مورد استفاده قرار می گیرد. وظیفه اصلی آن جداسازی ذرات و میکروارگانیسم ها از نمونه مایع یا گاز بر اساس اندازه آنها است. اندازه منافذ فیلترها بسته به نوع فیلتر و نیاز آزمایش می‌تواند متفاوت باشد. انتخاب اندازه مناسب منافذ برای حذف مؤثر ناخالصی‌ها و حفظ کیفیت نمونه بسیار مهم است.

نحوه انتخاب فیلتر برای فاز متحرک در کروماتوگرافی مایع

مطلوب است که عمر ستون HPLC را افزایش داده و تعمیر و نگهداری به دلیل وجود ذرات در سیستم پمپاژ کاهش یابد. با توجه به این فرض، اندازه منافذ فیلتر باید بر اساس اندازه ذرات پر شده ستون تعیین شود. همانطور که در شکل زیر می بینید، ذرات پر شده ستون با یکدیگر تماس دارند. در حالت ایده آل، نباید آلودگی در فضای بین ذرات پر شده قرار گیرد. این فضا با نام مسیر عبور یا Flow path در شکل زیر مشخص شده است.

 

هدف این است که مشخص شود فضای مسیر عبور چقدر بزرگ است تا بتوان ذرات با آن اندازه را حذف کرد. به عنوان مثال، اگر اندازه ذرات پرشده را 3 میکرومتر در نظر بگیریم همانطور که در شکل زیر نشان داده شده است، چند مثلث متساوی الاضلاع به خوبی در آن قرار می گیرد. بزرگ‌ترین ذره‌ای که می‌تواند در ستون قرار گیرد، با ترسیم مثلث متساوی الاضلاع با طول ضلع 0.75 میکرومتر تعیین می شود.

 

 

در صورتی که نمودار را بزرگ کرده و بهتر نگاه کنیم مجموعه ای از مثلث های متساوی الاضلاع را می توان تصور کرد که طول ضلع آنها به 0.75 میکرومتر می رسد. تصویر شماره 3 یک مثلث قائم الزاویه را نشان می دهد که ضلع کوتاه آن شعاع کره را نشان می دهد. زاویه یک نیمه 60 درجه یا 30 درجه است. ضلع افقی این مثلث قائم الزاویه جدید 0.375 میکرومتر (نصف 0.75 میکرومتر) طول دارد. با محاسبه مماس 30 درجه، نسبت طول ضلع مقابل به ضلع مجاور، در این مورد 0.58 است. این بدان معنی است که ضلع کوتاه مثلث برابر با 0.58، یا همان 0،375* 0.217 میکرومتر است. اتفاقاً این هم شعاع ذره است. بنابراین، اگر قطر ذرات پر شده ستون 3 میکرومتر باشد، مسیر جریان 0.43 میکرومتر است.

 

بنابراین، هنگامی که ستون HPLC با اندازه ذرات پر شده 3 میکرومتر یا کوچکتر باشد، باید از یک فیلتر 0.2 میکرومتر استفاده شود زیرا یک فیلتر 0.45 میکرومتر ممکن است ذرات را از خود عبور دهد و ستون را مسدود کند. برای سیستم های کروماتوگرافی مایع با استفاده از ستون هایی با ذرات پر شده بزرگتر از 3 میکرومتر، استاندارد غشای فیلتراسیون 0.45 میکرومتر برای فیلترهای غشایی فاز متحرک است. برای ستون‌هایی با ذرات پر شده 3 میکرومتر یا کوچک‌تر، از جمله دستگاه های UHPLC، ستون‌های ریز منفذ، یا زمانی که نگرانی بابت رشد میکروبی وجود داشته باشد، فیلتر 0.2 میکرومتری توصیه می‌شود.

 

چه نوع فیلتر غشایی در کروماتوگرافی مایع یا (HPLC) و کروماتوگرافی گازی یا (GC) استفاده می شود؟

 فیلترهای غشایی معمولاً قبل از تزریق نمونه به سیستم‌های HPLC (کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) و GC (کروماتوگرافی گازی) استفاده می‌شوند تا از ورود ناخالصی‌ها به سیستم جلوگیری کنند و دقت نتایج را افزایش دهند. استفاده از فیلترهای غشایی در مراحل آماده‌سازی نمونه، به ویژه در روش‌های آنالیزی مانند کروماتوگرافی، بسیار حائز اهمیت است و به بهبود کیفیت و دقت نتایج آزمایش‌ها کمک می‌کند.

فیلترهای غشایی در جداسازی زیستی در همه جا وجود دارند و عمدتاً برای جداسازی تقریبی مولکول ها بر اساس تفاوت در اندازه استفاده می شوند. با این حال، میل ترکیبی، تبادل یونی، برهمکنش آبگریز یا لیگاندهای فاز معکوس ممکن است به چنین غشاهایی (“فیلترهای میل ترکیبی”) جفت شوند تا گزینش پذیری آنها را برای مولکول هدف با چندین مرتبه بزرگی افزایش دهند. برای چنین اهدافی از مواد غشایی مختلف از جمله پلی آمید، سلولز احیا شده، پلی استایرن و کوپلیمرهای مختلف استفاده شده است. یکی دیگر از مزیت های فیلترهای غشایی مقاومت جریان کم آنها (فشار برگشتی) است. از آنجایی که راندمان جداسازی (ارتفاع صفحه) هیچ وابستگی به نرخ جریان نشان نمی دهد، جداسازی ها را می توان در عرض چند ثانیه با نرخ جریان بسیار بالا انجام داد، مگر اینکه سینتیک جذب در آنها محدودیتی ایجاد کند. کروماتوگرافی غشایی اغلب با استفاده از دستگاه های مشتق شده از واحدهای فیلتراسیون معمولی انجام می شود، اگرچه برخی از نگهدارنده های فیلتر وجود دارند که با سیستم های کروماتوگرافی معمولی یا آنالایزرهای تزریق جریان سازگار هستند.

چگونه فیلتر مناسب برای هدف خود در آزمایشگاه انتخاب کنیم؟

هنگام انتخاب بهترین فیلتر برای برنامه خود، باید به سه نکته اصلی توجه شود:

1. سازگاری شیمیایی فیلتر چیست؟ آیا فیلتر باید در برابر بازها، اسیدها یا حلال های آلی مقاوم باشد؟ هنگام انتخاب فیلتر برای آماده سازی نمونه یا فاز متحرک، سازگاری شیمیایی یک نکته مهم است.
2. فیلتر با چه مساحتی برای فیلتراسیون مورد نیاز است؟
3. اندازه منافذ بهینه برای فیلتر کردن نمونه چقدر است؟

بر این اساس دسته بندی از انواع فیلترهای غشایی پلیمری در جدول زیر ذکر شده است:

ماهیت فیلتر غشایی		خواص	کاربرد
نایلون	Nylon	آب گریز مقاومت خوب در برابر حلال ها چسبندگی پروتئین متوسط	برای فیلتراسیون همه نمونه های آبی و اکثر حلال ها (آلی)
تفلون	Teflon	آب گریز بالاترین مقاومت در برابر حلال ها چسبندگی پروتئین بالا .	برای فیلتراسیون محیط های غیر آبی و حلال ها (آلی) مناسب برای فیلتر کردن و گاززدایی در کروماتوگرافی
پلی وینیلیدین فلوراید آبدوست (هیدروفیل)	PVDF-HF	آبدوست مقاومت بالا در برابر حلال ها چسبندگی پروتئین بالاویژگی های Flow rate خوب	برای فیلتراسیون تمام محیط های آبی و بیشتر حلال ها (آلی) فیلتراسیون عمومی نمونه های بیولوژیک
پلی وینیلیدین فلوراید آبگریز (هیدروفوب)	PVDF-HB	آب گریز مقاومت بالا در برابر حلال ها چسبندگی پروتئین بالاویژگی های Flow rate خوب .	برای فیلتراسیون تمام محیط های آبی و بیشتر حلال ها (آلی) فیلتراسیون عمومی نمونه های بیولوژیک
سلولز استات	CA	آبدوست مقاومت محدود در برابر حلال ها پایین ترین چسبندگی پروتئین	ایده آل برای نمونه های آبی ایده ال برای کشت بافت و نمونه های بیولوژیکی حساس
سلولز احیا شده	RC	آبدوست مقاومت زیاد در برابر حلال ها پایین ترین چسبندگی پروتئین	ایده ال برای نمونه های آبی اختصاصاَ برای فیلتراسیون اثر آلودگی (عدم خلوص) پروتئینی
پلی پروپیلن	PP	آب گریز است . مقاومت بالا در برابر حلال ها در مقایسه با PVDF چسبندگی پروتئین پایینتر	فیلتراسیون تمام محیطهای آبی و بیشتر حلال ها (آلی) فیلتراسیون عمومی نمونه های بیولوژیکی
پلی اتر سولفون	PES	آب دوست مقاومت محدود در برابر حلال ها چسبندگی پروتئین پایین ویژگی های Flow rate خوب	ایده ال برای نمونه های آبی ایده ال برای کشت بافت و نمونه های بیولوژیکی حساس
میکروفیبر شیشه ای	GMF	به عنوان پیش فیلتر برای برطرف کردن ذرات درشت و کاهش هدر رفتن نمونه	فیلتراسیون عمومی نمونه های بیولوژیک کاربرد متنوع برای پاک کردن نمونه ها و پیش فیلتر کردن

• نمونه های آبی

غشاهای آبدوست یا هیدروفیل که میل ترکیبی با آب دارند هنگام فیلتر کردن نمونه های آبی ترجیح داده می شوند. از فیلترهای با غشاهای PVDF، نایلون یا PES می توان استفاده کرد.

• گازها و حلال های آلی خورنده

غشاهای آبگریز یا هیدروفوب آب را دفع می کنند و نسبت به حلال های آلی خورنده بی اثر هستند و آنها را برای گازها و حلال های آلی ایده آل می کند. در این حالت می توان فیلترهای با غشای PTFE را انتخاب کرد.

• محلول های حلال آبی و آلی

غشاهای پلیمری مختلف سازگاری شیمیایی متفاوتی دارند. بر اساس کاربرد و سازگاری شیمیایی، می توان یک یا چند نوع فیلتر غشایی یا سرسرنگی را انتخاب نمود. به طور کلی، یک نوع فیلتر به دلیل محدودیت در آبگریزی/آب دوستی و سازگاری شیمیایی برای همه کاربردها عمل نمی کند. با این حال، غشای پلی پروپیلن آبدوست یک غشای عمومی برای کاربردهای آبی و آلی است.

• سطوح فوق العاده پایین قابل استخراج

فیلترها برای افزایش دقت با حذف ذرات ناخواسته طراحی شده اند. با این حال، فیلتر نامناسب می تواند منبع آلاینده هایی به شکل مواد قابل استخراج باشد که از دستگاه فیلتر به نمونه شسته می شود. این مصنوعات نامطلوب می توانند نتایج آنالیز را به خطر بیندازند. برخی از نگرانی های قابل استخراج عبارتند از شویش ترکیبی[6]، خطا در مقادیر اندازه گیری شده، و پیک های مزاحم.

تفاوت بین فیلتر غشایی یا ممبران فیلتر PES و PVDF چیست؟

به طور خلاصه، غشاهای PES برای کاربردهای بیولوژیکی مبتنی بر آبی که نیاز به اتصال کم پروتئین دارند، ایده‌آل هستند، در حالی که غشاهای PVDF متنوع‌تر و از نظر شیمیایی قوی‌تر هستند و آنها را برای کاربردهایی با حلال‌های آلی یا نیاز به حفظ پروتئین بالا مناسب‌تر می‌سازد.

[1] microporous filter

[2] sieve filter

[3] Flow path

[4] High performance Liquid chromatography (HPLC)

[5] Gas chromatography (GC)

[6] coelution

مقاله مرتبط را مطالعه بفرمایید.